反恐精英旋风ak视频:请问分子病理学的地位和应用？

地位：分子生物学的发展, 是人们对肿瘤细胞增殖生长和转移过程中的信号转导通路作用机制研究的不断深入，继而为其特异性靶点而设计的分子靶向药物的开发,使肿瘤治疗已经进入了一个全新的时代。同时也为病理学提出了新的挑战，并注入了新的活力。病理学不再局限于组织和细胞水平的诊断，而开拓了分子病理学的新领域：不仅为寻找新的分子靶点提供线索，还可以通过基因检测为分子靶向治疗提供依据，从而使靶向治疗做到更有的放矢。目前有应用前景的靶点包括蛋白激酶、肿瘤血管生成、细胞周期调控等方面，这其中尤以针对突变激酶靶点的治疗取得的进展喜人。

分子病理学的应用
一、伊马替尼治疗胃肠道间质瘤（Gastrointestinal Stromal Tumors GIST）与c-kit、PDGFRA基因检测
Imatinib mesylate（伊马替尼，过去称STI157，商品名Glivec 或Gleevec）治疗GIST是近年来一个成功的分子靶向治疗模型，而有关GIST以基因型为基础的治疗还有许多问题有待解决。深入研究GIST的分子病理机制可以为完善其分子靶向治疗方案提供实验依据，并为其它肿瘤特异靶点的发现提供线索。
1.伊马替尼用于治疗GIST的分子基础
2001年伊马替尼的出现标志着针对肿瘤细胞信号转导通路的抗肿瘤战略取得了令人瞩目的突破。伊马替尼是一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂，是第一个基于对肿瘤细胞信号转导机制的认识而开发的抗癌药物，在原癌基因性的酪氨酸激酶和伊马替尼之间的基因型与药物的反应关系对于研发其它肿瘤的靶向信号转导抑制剂提供了一个有意义的模型[1]。最初伊马替尼的研发是作为血小板衍生生长因子受体 (PDGFR)的特异性抑制剂，而后发现其能选择性地抑制Bcr-Abl蛋白激酶从而抑制白血病细胞的生长及肿瘤的形成，且不影响对正常细胞生长和增殖起作用的激酶，对治疗Bcr-Abl 阳性的慢性粒细胞性白血病有较好疗效。Buchdunger等人后来发现伊马替尼还能阻断酪氨酸蛋白激酶受体KIT的功能，使人们把它与GIST联系起来。GIST对传统的化疗和放疗无效，临床试验证实伊马替尼对难切性和/或转移性GIST非常有效，目前已经用于晚期不能切除的GIST，而且开始应用于术后的高复发危险的患者的辅助治疗。我国自2001年亦开始应用伊马替尼治疗GIST，并获得相当效果。
GIST是胃肠道最常见的间叶性肿瘤，每年发生在美国至少为2000～5000例，在中国，发生率也有逐年上升的趋势。GIST可发生于胃肠道的任何部位，以胃和小肠最为多见，少部分发生于网膜、腹腔等。近年研究发现GIST与胃肠的间质Cajal细胞 (ICC) 在形态和免疫表型以及超微结构上具有相似性，都具有表达KIT蛋白的特征，提示GIST可能起源于向ICC分化的干细胞。由于目前普遍认为GIST没有绝对的良性，尚未发现可以特异性预测恶性转变的指标。依据Fletcher 2000年提出的GIST生物学行为分级标准可分为极低度、低度、中度和高度侵袭危险性，最终恶性的判断取决于肿瘤的复发或转移。这就为从分子病理学角度上重新认识GIST提出了迫切的任务。
由原癌基因c-kit编码的KIT蛋白属于III型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体（RTK），由胞内的酪氨酸激酶区、跨膜区和带有配体结合位点的胞外区构成。在与其配体干细胞因子（SCF）结合后发生二聚体化，激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，使受体残基发生磷酸化，引起胞浆内具有SH2功能域的信号转导蛋白与受体结合，进而激活下游的信号传导通路，如Ras/Raf/MEK/MAPK通路，PLC/DAG/IP3通路，PI-3K/AKT通路，JAK/STAT通路等，引起一系列的细胞变化，在包括增殖、粘附、凋亡和分化的肿瘤发生过程中调控细胞功能[2]。因此KIT原癌蛋白的表达是GIST发生的核心事件，也是目前普遍认可的确定GIST的特异敏感标准 (CD117阳性)。阐明KIT信号通路对临床同样具有重要意义。因为GIST病人可能最终对KIT抑制疗法耐药，因此人们正在努力研究发现下游信号中重要的蛋白分子以作为对KIT抑制疗法耐药的新靶点。
2．c-kit基因检测对伊马替尼治疗GIST的意义
1998年报道GIST中存在c-kit的基因突变，使其在无配体结合的情况下，KIT蛋白仍然能保持持续的自身酪氨酸蛋白激酶活性，从而激活下游的信号转导通路。目前认为kit的这种获得功能性的突变是GIST发生的重要机制。其中在kit基因编码近跨膜结构域的11号外显子中的突变最为常见，占50%～92%，此外在胞外结构域的9号外显子、激酶结构域的13号外显子和磷酸转移酶结构域的17号外显子的突变分别占8～13%、0～4%和0～4%。其中11号外显子的突变形式多样，包括框内缺失突变、点突变和框内串联重复（Identical Tandem Duplication ITD）插入突变。国内有关GIST分子检测的报道还很少，多集中在11号外显子突变，且样本量较小，突变率低，为30.8%（14/52）和41.5％（34/82），而未见9、13、17号外显子突变的报道。我们的60例GIST小样本研究显示其中38例（63.3％）检测到kit突变，均为CD117阳性：其中35例（58.3％）为11号外显子突变，2例（3.3％）为9号外显子突变，仅1例（1.7％）13号外显子突变，未检测到17号外显子的突变[3]。进一步扩大样本100例GIST中68％检测到kit突变(未发表)。似乎9号外显子在我国GIST的突变率明显低于国外，因为有研究指出9号外显子属于较特殊的一种突变亚型，往往发生在胃外，生物学行为属高度侵袭危险性。我国的这种（原诊断为恶性）GIST比例明显高于国外，且发生在胃外的并不少见，国人GIST是否有不同的基因突变位点谱，需要进行大样本研究。近来不少研究试图将突变比例与组织学特征和临床行为相联系，早期有一些报道进展期或高度侵袭危险性的GIST中突变多见，但目前多数报道提示基因突变情况与进展性行为有关的肿瘤大小、分裂相或分期等因素之间无明显相关性。国内相关文献均为高度侵袭危险性者突变常见，而我们的初步结果显示即使是因其它疾病偶然发现的直径小于1厘米的GIST中也有相当比例携带11号外显子突变，同Antonescu CR的结果一致。因此需要大样本进行统计分析，找寻我国GIST基因型与病理、临床特点间的规律，并进一步明确kit突变在GIST发生中的作用。
kit突变本身是否与病人的预后相关，目前尚无定论。有研究表明kit突变是一个生存的独立预后指标，即有突变者的5年生存率要低于无突变者。且有研究指出具11号外显子的点突变者较缺失和插入突变者生存率高。
伊马替尼的应用可明显改善病人的预后。已有资料证实kit突变的位置能影响GIST对伊马替尼的反应。一些体外和临床研究已表明突变在激酶位点的病例对抑制剂并不有效，如与肥大细胞增生症相关的激酶区D816V突变。幸好大多数kit突变都位于调控区即非酪氨酸激酶结构域，这就使抑制剂能有效地封闭酶位点。并且11号外显子有突变者与没有突变者和9号外显子突变者相比，对伊马替尼的部分缓解率（partial response rate）明显提高，平均生存期延长，病情进展缓慢[4～5]。
同时亦有研究提示伊马替尼可以通过促进NK细胞活性等其他途径来起到和增强其抗肿瘤作用。即使是KIT低表达的GIST, 伊马替尼亦具有一定的治疗作用。
因此检测病人手术标本中c-kit基因突变的情况对判断伊马替尼应用的预后有重要意义。
3．PDGFRA基因检测与GIST
对于缺乏 kit 突变的GIST的发生，近年来日益受到研究者的关注。由于发现即使是在包含野生型 kit 的GIST中KIT 也活化，就把人们的目光引向KIT 相关的受体酪氨酸激酶（RTK）。这一类RTK包括前原癌基因FMS，其编码巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF1) 的受体；两个PDGFR基因：包括PDGFRA和PDGFRB；FLT1与FMS相关的一个前原癌基因。其中PDGFRA 基因和 kit 基因位于人4号染色体的相邻位置上，两者的氨基酸序列有很高的同源性。近来国外报道在28%～67% 无kit突变的GIST中检出了 PDGFRA 的突变，并且 PDGFRA 突变与 kit 突变是相互独立的。因此目前认为获得功能性的 PDGFRA 突变很可能是 GIST 的另一个病因。一方面PDGFRA的信号转导通路与kit 相似，功能性的 PDGFRA 突变可以转化小肠的 Cajal 细胞；另一方面PDGFRA的功能性突变在293T 细胞中能与野生型的 kit 结合并使之活化。这一发现进一步证实了III型RTK的激活在促进GIST发生中的核心作用。国内尚无有关PDGFRA突变的报道。我们在60例中的3例检出了PDGFRA突变（5％），占无KIT表达病例的50％，全部为 18号外显子（活化环结构域）的点突变D842V，为最常见的突变形式。未检测到12号外显子（近膜结构域）的突变。与Medeiros等人的报道相似，此类突变多见于发生在网膜/肠系膜的恶性病例。而最近Lasota J的较大量病例研究表明PDGFRA突变主要发生在胃部，且大多生物学行为呈“良性”经过[6]。因此我国PDGFRA突变的突变情况还需扩大病例数进行研究。
目前证实PDGFRA 18号外显子突变对抑制剂疗效不明显，但仍有30％PDGFRA 突变的病例对伊马替尼敏感的报道提示我们应重视KIT阴性GIST的诊断问题以及应进行相应基因突变检测判断能否适用于伊马替尼治疗。
由此是否可能将GIST按照分子水平上的改变分成至少三种类型，即kit 突变型、PDGFRA突变型和无突变型。因此GIST可以看作是在大多数情况下由单独的分子机制所驱动的肿瘤。而绝大多数人类的癌发病机制复杂，如能按照具有明确的分子改变分类，就有可能针对每一类型实施以特定分子为基础的治疗。由于绝大多数GIST有KIT的高表达，即使是在不具有基因突变的病例中，因此这部分GIST的发生源于何种启动因素，目前尚无相关研究。Kit突变是GIST发生的早期事件，且具有突变的“良性”GIST 大多数并不进展为“恶性”，这表明kit突变本身并不能引起GIST的恶性转化。而导致GIST恶性转化的因素目前还未知。
4．c-kit基因、PDGFRA基因检测与伊马替尼治疗GIST耐药
尽管伊马替尼在治疗GIST上取得了令人鼓舞的成绩，却不可避免的出现了耐药的问题。初步的研究表明耐药包括KIT依赖性或KIT非依赖性机制。多数病例的耐药可能还是源于KIT的再活化。这其中部分病例是因为获得了存在于或者接近药物－蛋白相互作用位点的突变或是能导致蛋白构象发生改变而使KIT与伊马替尼亲和力降低的突变，削弱了药物的效能。最近Chen LL等人报道了5例具有对伊马替尼敏感的外显子9或11突变的GIST病人在用药过程中发生了耐药，获得一种新的点突变-V654V，位于kit酪氨酸激酶结构域[7]。这一耐药很可能是由于KIT蛋白构象改变所致。
有意思的是最近Debiec-Rychter报道了一个新机制：一例病人由kit-G565R突变通过PDGFRA次级突变D842V而对伊马替尼产生耐药[8]。这一现象表明对伊马替尼耐药可以通过另一个激酶的突变（如PDGFRA）而实现。部分病例对伊马替尼的不敏感可能与c-kit或PDGFRA基因扩增有关。因此对于GIST病人不主张使用传统化疗，可能会促进与疾病演进相关的克隆分化进展，产生影响药物反应的基因改变。KIT非依赖性机制耐药的提出是基于发现有病例彻底失去了KIT的表达。通过间期FISH证实标记的kit/PDGFRA基因在等位基因上丢失。同时他们还通过实验发现对伊马替尼耐药的几种突变对PKC412，另一种KIT和PDGFR的抑制剂， 反应敏感。这为寻找伊马替尼耐药的替代品提供了有意义的线索。部分病例发生耐药的原因还不得而知，还有很多问题需要进一步研究。
综上，深入研究GIST发生、发展及治疗有效、耐药的分子机制可以为生物靶向治疗提供依据和新的靶点。
二、 Herceptin治疗乳腺癌与HER2/ neu (cerbB2 )基因过表达的检测
1．Herceptin治疗乳腺癌的分子基础
HER2/ neu 是EGFR（表皮生长因子受体）家族的一员，此家族在细胞信号转导中发挥重要作用，是细胞生长、分化及存活的重要调节者。通常情况下，HER2/ neu 只在胎儿期表达。到成年后，只在极少数组织内有低表达。而HER2/ neu正常基因产物的过度表达，已证实在卵巢癌、肺腺癌、原发性肾细胞癌等，尤其是乳腺癌的恶性转化上起了关键性的作用，并且是预后不良的指征。
由于HER2/ neu 的过表达与肿瘤发生密切相关,人们找到了一种抗HER2/ neu 的抗体来下调其表达,命名为Trastuzumab ( Herceptin) 。其通过直接和间接两种机制影响肿瘤生长：直接机制是抗体与HER2/ neu 结合改变了受体的信号传导功能。间接机制是抗体通过ADCC 和补体依赖的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，还可诱导细胞分化,诱导细胞凋亡。目前已成功应用于治疗HER2/ neu基因扩增或过度表达伴或不伴腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者。Herceptin无论单用还是联合化疗，无论作为一线还是二线选择，都是一个治疗乳腺癌转移的重要选择药物。由于其毒副反应小，患者耐受性好，已成为靶向性治疗的成功范例。
2．HER2/ neu基因过表达的检测方法
如何准确、方便地检测出HER2/ neu基因过表达的乳腺癌病例，为运用Herceptin 治疗提供依据以及判断预后，就成为病理工作者不断研究的课题。
目前最常用的方法有ELISA、FISH（原位杂交免疫荧光）及IHC（免疫组化）法。ELISA法主要用于检测乳腺癌患者血清或新鲜组织中的p185 总蛋白。此方法敏感、 简单、安全且费用低，但仅适用于新鲜标本，不适用石蜡包埋组织。FISH法用于检查分裂期细胞的核型、识别染色体数目、确定肿瘤细胞的来源。此方法特异性高且稳定、敏感，能直接观察HER2/ neu基因的扩增量。 缺点主要是价格较贵，难以普及。IHC法因操作简便，目前被广泛应用。但假阴性较高，且对阳性信号程度的判读上主观因素影响较大。我们正在试验用real-time PCR（实时监测聚合酶链反应）来检测HER2/ neu基因过表达。这项方法是分析mRNA扩增的水平，基于实时检测PCR 扩增的产物,不需要一般的PCR 的产物处理,因而避免了因为操作所产生的各种问题[9]。能够动态监测整个PCR 过程,具有定量性和实用性。需要特别强调的是只有对上述检测方法进行统一规范化，才能提供准确的HER2/ neu基因状态，为治疗提供可靠的依据。
3. 其他
除了上述两种成功应用的药物外，还有许多分子靶向药物也显示出很好的应用前景。如部分肺癌病例，对EGFR抑制剂治疗有效，与其EGFR激酶结构域的突变有关。 近来抑制肿瘤介导的血管生成为肿瘤治疗提供了非细胞毒性的新途径。A vastin(Bevacizum ab, rhuMAb－VEGF) 是第一个人重组的抗VEGF 单抗, 能够结合并阻断VEGF (血管内皮生长因子) 的作用, 从而发挥抗肿瘤活性。其疗效除了与间质血管形成模式有关外，还与肿瘤表达VEGF的水平相关[10]。
可以预想，在今后对于肿瘤分子靶向治疗的研究和运用中，分子病理学必将起到更大的作用，同时，也促进其与临床紧密结合，向更具实用性发展。