北京著名的美食:实验采用脂肪酸甲酯标准物的峰高增量法定性怎么算？

1  实验原理

    因为油脂中的脂肪酸一般是以甘油酯形式存在，沸点较高，所以可利用快速酯交换先将油脂中的脂肪酸甲酯化后再进行气相色谱测定〔7〕。不同的油脂有不同的脂肪酸组成，其区别主要是在脂肪酸的碳链上含碳、不饱和键数量的差异，而气相色谱可利用色谱柱将脂肪酸甲酯随着碳原子数的增加，或不饱和键的数量多少来进行分离和测定。

2  实验部分

2.1  实验材料及试剂

真菌：贵州农学院虫生真菌实验室提供。

试剂：0.5 mol/l NaOH-CH3OH溶液；1∶1苯—石油醚混合溶液（试剂均为分析纯）；脂肪酸甲酯标准品（Sigma公司）。

2.2  仪器及测试条件

HP6890气相色谱仪，氢火焰检测器；

固定液为FFAP的石英玻璃毛细管柱，柱长25 m，柱径032 mm；

载气H2：81 kPa；分流比100∶1；燃气H2：30 ml/min；Air：400 ml/min；

进样口：250℃；检测器：250℃；

程序升温：190℃(1 min)—230℃(4 min)，每分钟升6℃。

2.3  真菌脂肪酸的快速甲酯化

    将真菌真空干燥后，取300 mg左右，研碎后放入10 ml具塞试管中，加入1∶1苯-石油醚2 ml，浸提15 min后，再加入0.5 mol/lNaOH-CH3OH溶液2 ml，振摇后置于50℃水浴约15 min，取出后沿管壁加入蒸馏水使有机层上升至试管上部，静置分层后，取上层清液2?l作气相色谱分析。

3  结果与讨论

3.1  定性及定量分析

    实验采用脂肪酸甲酯标准物作保留时间对照和峰高增量法定性。由于各脂肪酸为同系物，可以视相对校正因子为1，采取面积归一化法可测定脂肪酸组成。

3.4  方法的选择及优点

1.色谱柱的选择：考虑到脂肪酸酯类的极性，根据相似相溶原理，选用交联型固定液FFAP，它不仅适于分离脂肪酸酯类，而且热稳定性较好，高温不易氧化和流失；即便在高温操作，基线也只有很小的漂移。由于真菌的脂肪酸组成复杂，如用填充柱色谱，由于其柱效低，不能良好地分离各组分。而毛细管柱的柱径小，柱较长，因此柱效高，能使脂肪酸组分在柱内进行反复分配，并得以完全分离。因此选用毛细管气相色谱法测定。

2.载气柱前压的设置：载气压力设置过低，会使谱峰的半峰宽增加，或出现拖尾峰，分析时间也较长；载气压力过高，又会使相邻的峰不能完全分离，甚至出现谱峰重合现象。这些情况都会影响定性定量的准确性。经过多次实验，结果表明，当设置载气柱前压为81 kPa时，与柱前压为50 kPa时相比，出峰时间提前了近一倍，并且不影响出峰数目及分离效果，能准确地分离出30多种组分。

3.程序升温的设置：由于真菌的脂肪酸组成很复杂，如果采用恒温分析，谱峰无法得到良好的分离，所以需要设置程序升温，使各个组分按沸点高低依次出峰。多次实验表明，程序升温190℃(1 min)—230℃(4 min)，每分钟升6℃ ，在此条件下，能分离出30多个组分，并且EPA出峰时间还不到6 min，只需要10 min即可完成一次分析。

4  总  结

    由测定结果可看出，本方法能准确地分离和测定真菌中的主要脂肪酸，有较好的精密度和较高的可靠性，EPA出峰时间仅为5.905 min，只需10 min即可完成一次分析。从气相色谱图也可看出，谱峰分离效果好，能分辨出真菌中的约30种脂肪酸。因此本文为真菌脂肪酸组成的测定和具有商业价值菌株的筛选提供了一个较为可行的分析方法。筛选出的真菌虽然EPA含量较少，但有望通过优化发酵条件以提高EPA的产率并通过生物工程培养出含EPA和DHA更多的具有商业价值的菌株。另外，本实验采用脂肪酸甲酯标准物对照定性，已鉴别出了8种主要的脂肪酸，而其他的组分还需结合GC-MS来定性研究。