雪中梅花图片简笔画:细胞生物学11

蛋白质、酶和核酸这三大类物质都是生物大分子，它们都具有十分重要的生理功能。酶是生物催化剂，核酸是遗传信息的携带者，蛋白质是生命现象的基础。因此对生物大分子的结构与功能的研究，具有十分重要的理论和实践意义。而这研究的首要条件是制备高纯度的生物大分子，否则对其结构与功能的研究就无从谈起。

2．制备方法的分类：

依理化性质，分离、纯化生物大分子的方法可分四个类型：

(1)按分子大小和形态：采用高速离心、过滤、分子筛、透析等方法。

(2)按溶解度：采用盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配、结晶等方法。

(3)按电荷差异：采用电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析、吸附层析等方法。

(4)按生物功能专一性：采用亲和层析法。

3．制备的总体思路：

一般可分为六个阶段：

(1)材料选择与预处理：动物、植物和微生物都是制备生物大分子的材料，选什么材料主要依靠实验的目的而定，选材料时应注意以下几个问题：

①使用的目的：从科学实验的特殊需要出发，选材时需求能符合实验预定目标即可。

②材料的生理状态差异：选材时要注意植物的季节性，微生物的生长期和动物的生理状

态。如：微生物生长的对数期，酶与核酸的含量较高。

材料选定后，通常要进行预处理，如动物组织要剔除结缔组织，脂肪组织等非活性部位，植物种子先行去壳、除脂、微生物需将菌体和发酵液分离开，暂时不用材料尚需冰冻保存。

（2）细胞的破碎及细胞器的分离

①细胞的破碎：除了提取液和细胞外某些多肽激素、蛋白质和酶不需破碎细胞膜，对于细胞内和多细咆生物组织中各种生物大分子的分离提纯都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，不同生物体，或同一生物体的不同组织，其细胞破碎难易不一致，因此使用方法也不完全相同，通常两种方法共同使用。

A． 高速组织捣碎机

玻璃匀浆器

研磨

机械切力的作用

物理方法：

反复冻融法

冷热交替法

超声波处理法

加压破碎法

物理因素的作用

B．化学及生物化学法

自溶法

溶菌酶处理法

表面活性剂处理法

改变细胞膜透性法

但是，不管采用哪种方法，都需要在一定稀盐溶液或缓冲溶液中进行，且需加某些保护剂，以防止生物大分子的变性及降解。

②细胞器的分离：制备某种生物大分子时，往往需要采用细胞中某一部分为材料；或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，通常破碎细胞后，先分离各组分，以防干扰，这对制备—些高难度和高纯度的生物大分子是必要的，细胞器的分离，一般采用差速离心法，此法是利用细胞各组分质量大小不同，在离心管不同区域沉降的原理，分离出所需组分，分离得到的细胞器，其纯度可采用电子显微镜法、免疫学法或测定标志酶活力法进行鉴定。

(3)提取：

提取又称抽提或萃取，其作用是将经过处理或破碎了的细胞置于一定的条件和溶剂中，让被提取的生物大分子充分地释放出来，提取效果如何，取决于该物质在溶剂中溶解度的大小和该物质的分子结构及使用溶剂的理化性质。原则地说，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性有机溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂中；温度高时，一般溶解度相应增大，在远离生物大分子等电点的pH值时溶解度增加，从细胞中提取生物大分子也受扩散作用的影响和分配定律的支配。由于影响因素较多，在实际制备时应根据经验并结合具体实验条件灵活地加以应用。

(4)分离纯化

从细胞中提取出来的生物大分子是不够纯净的，常含许多同类的或异类的物质，必需进一步分离纯化才能获得纯品。生物大分子制备工作中，分离纯化这一步既重要又复杂，主要方法可归纳为两类：

①对异类物质的分离：常采用专一性酶水解，有机溶剂抽提，选择性分部沉淀和液固相转化透析分离等方法。

②对同类物质的分离：常采用盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、结晶、电泳、超离心、柱层析和吸附等方法。

(5)浓缩与结晶

①浓缩是指低浓度溶液通过除去溶剂(包括水)变为高浓度溶液的过程，常在提取后结晶

前进行，有时也贯穿在整个制备过程中。浓缩的方法常采用：

A．蒸发法：薄膜蒸发浓缩，减压加温蒸发浓缩，空气流过蒸发浓缩。

B．冰冻法。

C．吸收法。

D．超滤法。

②结晶是指使溶质呈晶态从溶液中析出的过程。结晶除作为生化制备一种纯化手段外，其结晶化合物还常常是生物大分子结构的分析研究的材料，常用以下几种方法进行结晶。

A，盐析法：加固体盐法、加饱和盐溶液法、透析法。

B．有机溶剂法。

C．等电点法。

D．脱盐结晶法。

E．加金属离子结晶法。

(6)干燥与保存：

干燥是指将潮湿的固体、半固体或浓缩液中的水分(或溶剂)蒸发除去的过程，最常用的方法是真空干燥和冷冻干燥。

保存是指样品如何存放的问题，保存方法与生物大分子的稳定性密切相关，常采用干态贮藏和液态贮藏的方法。干态贮藏法就是将干燥后的样品置于干燥器内(内装有干燥剂)密封，保持0—4℃冰箱中即可；液态储藏法，首先免去烦杂的干燥过程，生物大分子的活性和结构破坏较少，但应注意样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装储藏，必需加入防腐剂和稳定剂。常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等。另外要求储藏温度较低，大多数在0℃左右冰箱保存，有的则要求更低的温度。但不管采用哪种方法，都必须避免长期暴露在空气中，以防微生物的污染。

(二)鉴定

经过一系列的分离纯化，所得到的物质是不是我们所需要的，样品的纯度如何，都需要进行进一步的鉴定，包括纯度鉴定、性质与功能鉴定，结构鉴定等，鉴定的方法也很多，具体实验中可根据研究的需要选择某些方法。

1．纯度鉴定

(1)电泳法：纯的蛋白质、核酸样品在它稳定的范围内，在一系列不同的PH条件下进行电泳时，都以单一的泳动速度移动，因此在区带电泳中，它的电泳图谱只有一个条带，蛋白质一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋纤薄膜电泳等，核酸样品一般采用琼脂糖电泳。

(2)沉降分析法：纯的蛋白质、核酸样品在离心力的影响下，以单一的沉降速度运动，离心后只能得到一个条带。

(3)恒溶度法：纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖于存在于溶液中未溶解固体的数量。在严格规定的条件下，以加入的固体蛋白质的量为横座标，以溶解的蛋白质的量为纵座标作图，如果蛋白质样品是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点，在折点之前，直线的斜率为l，在折点以后，斜率为零，不纯的蛋白质的溶解度曲线常常呈现两个或两个以上的折点。

2．性质与功能鉴定

(1)分子量测定：蛋白质、核酸样品都可以通过适当的实验方法，测定出样品的分子量。蛋白质可以采用渗透压法、沉降分析法、通透层析法、SDS-PAGE电泳法等，核酸样品可采用琼脂糖电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。

(2)蛋白质等电点测定：可通过等电聚焦电泳法。

(3)功能鉴定：具有酶或激素性质的样品可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量，

而不具有酶或激素活性的蛋白质，可以先用来免疫适当动物，一般会产生抗体，利用抗原—抗体反应，也可以测定某一特定蛋白质的含量，这些生物学方法的测定和总蛋白质测定配合起来，可以用来研究蛋白质分离过程中某一特定蛋白质的提纯程度，提纯程度常用这一特定成分与总蛋白之比来表示，提纯工作一直要进行到这个比例不再增加为止。

3．结构鉴定

(1)末端测定：可采用DNS—氨基酸或DNP—氨基酸聚酰胺薄膜层析法测定。

(2)组成分析：把样品完全水解后进行氨基酸或核苷酸的组成分析，并计算出各种氨基酸或核苷酸的分子比。

(3)“指纹”分析：将制备的样品与标准样品在相同条件下用蛋白酶或核酸内切酶进行部分水解，再进行电泳，通过电泳图谱的比较，可以判断所分离到的样品是否是所需要的成分。

(4)序列测定。

(5)探针技术：把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相支持体，然后用已放射性标记或酶标记的针对特定氨基酸序列或核苷酸序列的特异性试剂作为探针检测之。探针技术特异性强，灵敏度高，而且样品无需经过复杂的分离纯化即可进行鉴定，因此在分子生物学中得到了广泛的应用。目前主要有三种技术：

①Southern blotting：1975年由Southern提出的转移技术，通常用来对DNA特定序列进行定位、鉴定。先将DNA样品通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体(通常是硝酸纤维膜或尼龙膜)上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片段的相对位置保持不变，用放射性标记的DNA或RNA片段作为探针与固着在固相支持体上的DNA进行杂交，经放射自显影后可以确定与探针互补的DNA片段的电泳条带的位置。

②Northern blotting：1977年由Alwine等提出的转移技术，可用于测定总RNA或poly

(A)+RNA样品中特定mRNA分子的大小和丰度。 RNA分子在变性琼脂糖凝胶中按其大小不同而相互分离，随后将RNA转移至活化纤维素、硝酸纤维膜、玻璃或尼龙膜，用放射性标记的与待测RNA分子互补的DNA或RNA探针进行杂交和放射自显影，以对待测的RNA分子进行作图。

③Western blotting：1979年由Towbin等人提出的蛋白质转移技术，用于对非放射性标

记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白质进行鉴别和定量。通常使用的探针是抗体，它可与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应，先将待测样品溶于含有去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持体上(常用硝酸纤维滤膜)然后可被染色，随后滤膜可与抗靶蛋白的非标记抗体反应，最后结合上的抗体可用多种放射性标记或酶偶联的二级免疫学试剂进行检测。